Светлопольная микроскопия принцип работы, виды, методы, недостатки световой микроскопии

Светлопольная микроскопия принцип работы, виды, методы, недостатки световой микроскопии

Источники света в оптической микроскопии

В оптической микроскопии источник света играет очень важное значение в формировании изображения. Грамотный выбор источника света позволяет успешно проводить множество исследований, будь то рутинная задача анализа мазка или гистологического препарата, вплоть до сложнейшей многоканальной конфокальной микроскопии. В статье мы рассмотрим самые популярные на сегодняшний момент источники света, преимущества и недостатки «конкурирующих» систем для решения схожих задач, возможности применения того или иного источника света в зависимости от поставленной задачи.

Галогенная лампа (Halogen bulb)

Галогенные лампы в современных микроскопах встречаются наиболее часто, хотя в последнее время их активно вытесняет светодиодное освещение. Их основное применение – светлопольная микроскопия в отраженном и проходящем свете. Поляризационные исследования, решение множества материаловедческих и биологических задач, где необходимо получать изображения в видимом свете без применения флуоресценции.

Галогенная лампа 6V 20W широко используется в рутинных микроскопах проходящего света

В микроскопах используются галогенные лампы различной мощности (от 20 до 100 Вт). Цветовая температура галогенных ламп находится в районе 3400К (100W Philips 7023). Свет галогенных ламп подчеркивает теплые тона, смещен в сторону теплых оттенков, поэтому для получения изображений, приближенных к цветовой температуре дневного освещения, обычно используют цветобалансирующий фильтр (LBD или Daylight filter).

LBD фильтр для коррекции цветовой температуры 100 Вт галогенной лампы

Достоинства галогенных ламп – малый размер осветителей, отсутствие необходимости активного охлаждения (достаточно пассивной вентиляции), невысокая стоимость и хорошая цветопередача.
К недостаткам можно отнести сравнительно низкую яркость, малый срок службы около 50 часов.

Ртутная флуоресцентная/люминесцентная лампа HBO (Mercury HBO Lamp)

Ртутные газоразрядные лампы высокого давления применяются для получения качественных флуоресцентных изображений. Они в 10-100 раз ярче ламп накаливания и могут обеспечить интенсивное освещение в выбраном диапазоне длин волн по всей видимой и УФ области спекта при использовании соответсвующих фильтров.
Этот источник света очень надежен и дает хорошую плотность светового потока.

Ртутная флуоресцентная лампа HBO 100

Самой популярной ртутной лампой, применяемой в микроскопии, является лампа HBO 100W. Уникальная спектральная характеристика лампы идеально подходит для исследователей, занимающихся флуоресценцией. Только треть спектра испускания лампы находится в видимой области. Около половины спектра лежит в ультрафиолетовой области, поэтому при работе с подобными источниками необходимо уделять должное внимание защите, в первую очередь, глаз исследователя, а во вторую очередь, стойкости к УФ излучению исследуемых препаратов. Остальная часть излучения ртутной лампы рассеивается в виде теплового длинноволнового ИК излучения.

Спектральная интенсивность ртутной лампы HBO 100

Ртутная газоразрядная лампа имеет одно из самых высоких значений яркости среди непрерывно работающих источников света и очень тесно приближена к идеальной модели точечного источника света. Тем не менее, ртутные лампы имеют большие колебания интенсивности, зависящие от эрозии электродов, магнитных полей в помещении, а также периодическое отклонение дуги (флаттер), возникающее из-за конвекционных потоков в парах ртути. Эти особенности ртутной лампы препятствуют ее использованию в количественных оценках флуоресценции (измерение яркости флуоресценции и т.п.)

Читайте также:  Лечение пролежней в домашних условиях 1

Ламповый домик ртутной лампы HBO 50. Имеются регулировочные винты настройки положения лампы, зеркала а также мощный радиатор, позволяющий отводить тепловое излучение.

Помимо перечисленных артефактов дуговой природы света ртутной лампы, у нее есть ряд следующих недостатков: малый срок службы (200 часов), значительное изменение спектральной характеристики в зависимости от возраста лампы, необходимость временных промежутков между включениями для полного остывания лампы.
В типовой конфигурации оптического микроскопа, ртутная лампа находится внутри специализированного осветителя, состоящего из корпуса лампы, вогнутого зеркального рефлектора, а также регулируемой системы линз коллектора для фокусировки дуги лампы.

В зависимости от конструкции, ртутный ламповый домик (это микроскопический термин, в английском языке lamphouse) может также содержать фильтры, блокирующие УФ излучение лампы, а также Hot Mirror фильтры для снижения теплового излучения, нагревающего внутренние линзы микроскопа и исследуемый образец.

Ртутная лампа требует тщательной юстировки для освещения образца равномерным полем максимальной интенсивности. Подробно настройка ртутного лампового домика описана в статье «Юстировка лампового домика флуоресцентной лампы HBO».

Металлогалоидные лампы (Metal Halide Arc Lamps)

Сегодня металлогалоидные лампы постепенно вытесняют ртутные и ксеноновые лампы с позиции флуоресцентных источников.

Конструктивно такие осветители выполнены в виде высокопроизводительной дуговой лампы, размещенной на эллиптическом отражателе. Отражатель фокусирует свет на торце жидкого световода для последующей передачи его на вход оптической системы микроскопа. Иногда металлогалоидные осветители дополнены колесами фильтров (filter wheels) для выбора необходимой длины волны возбуждения, а также специальными шиберами и нейтральными фильтрами для коррекции плотности и интенсивности освещения. Спектр металлогалоидной лампы имеет схожие очертания с «ртутным» спектром, однако более сильная межпиковая интенсивность вместе с большей шириной пиков позволяет получать флуоресценцию на 50% мощнее чем ртутные лампы HBO 100.

Спектральная чувствительность металлогалоидной лампы в сравнении со ртутной лампой HBO. Интенсивность пиков металлогалоидной лампы немного ниже, но мощность в межпиковых областях и ширина пиков позволяют получать качественные флуоресцентные изображения.

Металлогалоидные лампы прекрасно подходят для экспериментов с живыми клетками с использованием EGFP (зеленый флуоресцентный белок). Кроме того они производят гораздо более равномерное освещение в пространстве из-за конструкции жидкого световода и конденсора. Более равномерная жизненная характеристика лампы вместе со сроком службы в 2 тысячи часов (против 200 часов у ртутных осветителей) позволяют проводить количественные анализы флуоресценции.

Светодиодные источники света (Light-Emitting Diodes, LEDs)

Светодиодные источники света – самое перспективное направление из новых технологий в микроскопии. Эти универсальные полупроводниковые осветители обладают всеми функциями ламп накаливания и газоразрядных ламп, имея при этом возможность работать от батареек, а также низковольтных и недорогих импульсных блоков питания.

Читайте также:  Кандидоз желудка – причины, симптомы, лечение

Разнообразные спектральные характеристики LED осветителей позволяют выбрать необходимый светодиод и установить оптимальное возбуждение в диапазоне длин волн, охватывающем ультрафиолетовую, видимую и ближнюю ИК области. Кроме того, новые мощные светодиоды обладают достаточной интенсивностью для получения качественного флуоресцентного изображения.

Спектральная характеристика светодиодов, использующихся в световой микроскопии.

Компактные светодиоды можно комбинировать в одном ламповом блоке для получения мультиканального флуоресцентного изображения, либо для получения UV и видимого изображения.

Светодиодный осветитель, комбинирующий три светодиодных источника при помощи полупрозрачных зеркал. Позволяет работать с мультиканальной флуоресценцией.

Существует возможность устанавливать современные светодиодные осветители в микроскопы заказчика вне зависимости от возраста и состояния прибора. Эта процедура позволяет вывести качество изображения на новый уровень при использовании старой оптики и при минимальных финансовых затратах. Подробнее об этом можно прочитать в статье Модернизация микроскопа. LED Освещение.

Преимущество световой микроскопии перед электронной

В настоящее время уже всесторонне доказано преимущество световой микроскопии перед электронной, каково преимущество использования световой микроскопии перед электронной. Первую признали позволяющей достичь увеличения картинки в 2-3 тыс. раза. Ее достоинства сформированы:

  • возможностью получить цветное и подвижное изображение даже в том случае, когда объект движется;
  • реальностью микрокиносъёмки;
  • долгим наблюдением за одним и тем же предметом, которое раньше было не под силу приборам такого типа;
  • анализом динамики и химизма любого элемента, которые раньше не удавалось всесторонне оценить.

Область репродуктологии особенно часто требует применения новейших технологий для проведения исследований образцов спермы. Именно световая микроскопия в этом случае может обеспечить предоставление максимально детализированных сведений об образце.

Она расширила границы анализа клеток семенной жидкости. Сочетание ее с иммуноцитохимическими и гистохимическими подходами завершило ряд технических усовершенствований, которые объединяют структурные и функциональные возможности. Это обеспечивает проведение всестороннего анализа семенной жидкости на клеточном уровне для решения проблем с бесплодием. Когда эти методы используются вместе, их разрешающая способность увеличивается до субклеточного уровня. С учетом этих достижений детальное изучение сложной структурной и молекулярной организации клеток, а также химического состава семенной жидкости теперь стало реальным.

Выясняя, каково преимущество световой микроскопии перед электронной, следует в первую очередь обратить внимание на существенную разницу в пользу первой в уровне показателей разрешающей способности, контрастности и других характеристик.

Если рассмотреть более подробно, каково преимущество использования световой микроскопии перед электронной, то станет очевидно, что благодаря разрешающей способности первой, достигается более информативный вариант минимального расстояния, на котором размещаются две точки. Их прибор должен позволять увидеть по отдельности.

Электронно микроскопическое исследование спермы становится и более точным за счет контрастности картинки. Эта характеристика отвечает за отличие между яркостью и фоном изображения. Контрастность зависит от свойств предмета, изменяющих освещающий поток, и возможностей оптики, которая должна улавливать любые из этих изменений.

Читайте также:  МАСЛО ТАВОЛГИ (ЛАБАЗНИКА) КОПИЛКА ЗДОРОВЬЯ» - Масла для здоровья

Сравнение электронного и светового микроскопов

Принцип ЭМ. В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током (рис. 12).

Рис. 12. Схема электронного микроскопа

Электронные лучи обладают малой длиной волны. Прохождение электронных лучей в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами, концентрирует и направляет электронный поток. Это обеспечивает резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа до 0,2 нм и увеличение до 10 9 .

В трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопах электроны проходят через образец, затем собираются и фокусируются электромагнитными линзами. Электроны невидимы для глаза, поэтому они направляются на флюоресцентный экран, который воспроизводит видимое плоскостное изображение, или на фотоплёнку, чтобы получить постоянный снимок (электронную микрофотографию).

Рис. 11. Электронный микроскоп

Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны больше или меньше задерживаются, а объект приобретает контрастность. Создаёт изображение только та часть электронов, которая проходит через объект и попадает на экран микроскопа. Участки клеток, слабо рассеивающие электроны, выглядят на экране светлыми, а участки, сильно рассеивающие электроны, – тёмными (рис. 13).

Рис.13. ВИЧ в трансмиссионном электронном микроскопе

В сканирующих электронных микроскопах пучок электронов фокусируется в тонком зонде и им сканируют образец, а отраженные от поверхности образца электроны собираются и формируют на экране объемное изображение (рис. 14-17). При сканирующей электронной микроскопии изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют реплики, повторяющие контуры образца.

Рис. 14. ВИЧ в сканирующем электронном микроскопе

Рис. 15. Trichomonas vaginalis в сканирующем электронном микроскопе

Рис. 16. Staphylococcus aureus в сканирующем электронном микроскопе

Рис. 17. Макрофаги и фагоцитируемые ими

Параметр Электронный микроскоп Световой микроскоп
Источник излучения электроны свет
Длина волны 0,005 нм 400-700 нм
Максимальное полезное увеличение х2500 х1500
Максимальное разрешение 0,2 нм 200 нм
Линзы электромагниты стеклянные
Объект не живой, обезвоженный, маленький или тонкий живой или неживой
Красители содержат цветные металлы, которые отражают электроны цветные

Преимущества электронной микроскопии:

· высокая разрешающая способность электронного микроскопа позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Поэтому ЭМ применяется для изучения ультраструктур микроорганизмов и макромолекулярных структур;

· сочетание ЭМ с другими методами позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования. ЭМ нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии, генетике, биохимии, онкологии.

Дата добавления: 2015-02-23 ; просмотров: 7802 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Ссылка на основную публикацию
Саркомы костей лечение и диагностика
Саркома Юинга Саркома Юинга находится на втором месте по распространенности среди первичных злокачественных опухолей костей, на нее приходится 10–15% всех...
Салон красоты Акцент на; метро Зябликово (на; Воронежской улице, метро Красногвардейская)
Пирсинг крыла носа в Москве Найдена информация о 89 подходящих студиях татуировки. Пирсинг крыла носа - цены и отзывы. Сравнительная...
Салоны красоты с выпрямлением волос (метро Павелецкая) часы работы и адреса, где сделать выпрямление
Отзывы о салоне Нола на Татарской улице Уважаемая Tatiana Rafikova!Вы обратились в Салон Нола после осветления волос в другом салоне.Стилист...
Сахар — калорийность, свойства, польза
Какова калорийность сахара в 100 гр, кубике, чайной и столовой ложках «Сахар есть вредно» — сей постулат прочно вошел в...
Adblock detector